protein-fa.htm

Da die Sequenz und Struktur eines jeden Proteins durch eine spezifische kodierende DNA-Sequenz festgelegt wird, können auch Protein-Fingerprints letzlich Aussagen über die genetische Ausstattung einer Art machen. Ähnlich wie beim DNA-Fingerprinting kann man durch Protein-Fingerprinting also evolutionäre Verwandtschaftsverhältnisse beschreiben.
Um z.B. Lachs, Forelle, Stör, Wels und Zander zu unterscheiden, muss man die verschiedenen Fischmuskelfleisch-Proben in ihrem Proteinmuster vergleichen. Muskel-Protein besteht überwiegend aus den Proteinen Actin und Myosin - diese Proteinausstattung ist also bei den verschiedenen Fischarten sehr ähnlich. Viele andere Muskelproteine sind jedoch selbst bei eng verwandten Arten sehr verschieden und dienen in unserem Versuch als arttypischer Protein-Fingerabdruck.
Wie beim DNA-Fingerabdruck wird wieder eine Sortierung nach der Molekülgröße vorgenommen. Man lässt die Proteinmoleküle  -unzerschnitten, aber hitzedenaturiert- in einem elektrischen Feld durch die Poren eines Gels wandern, und erhält wie bei der DNA ein charakteristisches Bandenmuster.
in diesem Fall handelt es sich um ein SDS-Polyacrylamid-Gel.  Es trennt, ähnlich wie ein Agarose-Gel Proteingemische nach Molekülgröße. 
Die von verschiedenen Fleischsorten (z.B. Rind, Schwein, Pute) oder Fleischgemischen (z.B. Lyoner, Salami) erhaltenen Protein-Fingerprints werden anhand von bestimmten typischen Banden z.B. als Rindfleisch identifiziert.

Bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Gemische verschiedener Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Proteinproben werden durch Zugabe des starken Detergens (=Seife) SDS (Natriumdodecylsulfat) und ß-Mercaptoethanol (=Reduktionsmittel) und anschließendes Erhitzen  (95^oC) denaturiert. Alle Proteine liegen im Anschluss an diese Denaturierung in einer ähnlichen, stäbchenartigen Form vor und sind durch das SDS stark negativ geladen. Das ß-Mercaptoethanol reduziert, d.h. spaltet eventuell vorhandene Disulfidbrücken innerhalb oder zwischen den Molekülen.

Legt man nach Auftrag der Proben auf das Gel ein elektrisches Feld an, wandern die Proteine zur Anode (+). Die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine hängt dabei fast nur von ihrem Molekulargewicht ab; ihre Eigenladung ist durch das SDS völlig überdeckt. Das SDS-PAGE kann man sich als eine Art Molekularsieb vorstellen, das aus langen Polymeren des Acrylamids besteht und durch Bisacrylamid quervernetzt wurde. Größere Proteine werden im Geflecht stärker zurückgehalten, wandern also langsamer.
Die zu untersuchende Proteinprobe wird mit Laemmli-Puffer versetzt, der neben ß-Mercaptoethanol und SDS noch Bromphenolblau enthält, das den Fortlauf der Elektrophorese anzeigt. Bromphenolblau wandert aufgrund seiner physikalischen Eigenschaften immer vor der Proteinfront. Glycerin als weiterer Bestandteil sorgt durch seine hohe Dichte für einen einfachen Probenauftrag auf das Gel.
Trägt man parallel zur Proteinprobe einen Molekulargewichtsstandard (Proteinmarker) mit Proteinen bekannter Molekulargewichte auf, kann man über einen Bandenvergleich Molekulargewichte in der Probe grob abschätzen.

SDS-PAGE werden oft angewandt, um Ergebnisse biochemischer Protein-Experimente auswerten zu können oder auch um die Reinheit isolierter Proteine überprüfen zu können.
Um die Trennung der Proteinmoleküle zu verbessern, wird mit 2 verschieden großen Porengrößen im Gel gearbeitet: Sammelgel und Trenngel. (s.Durchführung)

Rotiphorese Gel Fertig-Lösung (Acrylamid)

SDS-Lösung 10%   (Sodiumdodecylsulfat)

dest. Wasser  

APS-Lösung 10% (Ammoniumperoxodisulfat): Starter

TEMED (Tetramethylethylendiamin) Radikalbildner 

Rotiphorese Gel 30 Lösung (Acrylamid)

830µL

APS-Lösung 10% (Ammoniumperoxodisulfat) : Starter

TEMED(Tetramethylethylendiamin) Radikalbildner

Zur Vorbereitung der Proben sollten Einmalhandschuhe getragen werden, da die Eppendorf-Gefäße durch die Hitze aufspringen können! 
Am besten während der Inkubation bei 95 °C den Thermoblock mit einem Gewicht beschweren. Wenn man die Proben dann nach 10 min in ihrem Gestell und mit Gewicht vom Thermoblock abnimmt, kann man sie kurz abkühlen lassen.

4) Dieser Ãœberstand mit dem denaturierten Proteingemisch wird weiterverwendet für die Gel- Elektrophorese. ( Bei Bedarf könnten die Proben jetzt zur Aufbewahrung eingefroren werden)

Gießen des Gels: Eine Glasplatte mit integrierten Abstandhalter (0.75 mm) und eine plane Glasplatte werden mit Ethanol und einem weichen Papiertuch gereinigt. Die beiden Glasplatten (kurze Platte und Platte mit aufgeklebten Abstandhaltern) werden so zusammengesetzt, dass zwischen den Platten ein flacher Hohlraum entsteht. Die beiden Platten werden zusammen als Gelkassette in den grünen Gelrahmen eingesetzt, so dass die kürzere Platte - wie auf dem Bild zu sehen - nach vorne zeigt: Die beiden Hebel des Gel-Rahmens werden nach außen gedrückt: Der Gelrahmen wird anschließend in den Gießstand eingesetzt, indem die Klammer am oberen Rand der Apparatur gedrückt wird. Durch die Klammer werden die Platten gegen die untere graue Gummileiste gedrückt und damit nach unten abgedichtet. Mit einem wasserdichten Filzschreiber wird ca. 1 cm unterhalb der oberen Glasplattenkante eine Markierung angebracht, um die Trenngelhöhe festzulegen.

5 mL der vorbereiteten Trenngellösung wird mit 30 µl der 10%igen APS-Lsung sowie 3 µl TEMED versetzt und zügig mit der 1000µl -Pipette in den Hohlraum zwischen die beiden Glasplatten pipettiert bis das FlÃüsigkeitsniveau bis zur Markierung angestiegen ist. Anschließend wird zu Glättung mit Isopropanol überschichtet (ca. 5 mm hoch). Nach ca. 10 bis 15 min ist das Trenngel polymerisiert. Das Isopropanol wird weggegossen, die Oberfläche vorsichtig mit dest. Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet.

Alle Bestandteile der Apparatur werden in umgekehrter Reihenfolge wieder auseinandergenommen, bis man die Gelkassette mit dem SDS-Gel vor sich liegen hat. Diese wird unter Zuhilfenahme eines Spatels oder grünen Keils von BioRad vorsichtig aufgehebelt und das Gel in die Coomassie-Färbelösung (ca.100 mL) überführt. Nachdem die Lösung in der Mikrowelle auf ca. 80^oC gebracht wurde, wird für ca. 20 min unter ständigem Schwenken gefärbt. 

2) Coomassie-Entfärbelösung:
Anschließend wird der Färber in das Vorratsgefäß zurückgegossen und das Gel mit 100 mL Entfärber erneut in der Mikrowelle erwärmt. Nach ca. 30 - 60 min ist das Ergebnis der SDS-PAGE auf einem Leuchttisch (Tageslichtprojektor) zu erkennen. Ein Austausch der Entfärbelösung gegen frischen Entfärber beschleunigt den Entfärbevorgang.

Man erkennt, dass jede Fleischart (Pute, Rind, Schwein) ein ganz charakteristisches Muster an Proteinbanden zeigt. Bestimmte Banden kommen nur in einer der untersuchten Fleischsorten vor und können so auch zur Identifikation von Fleischsorten dienen (s. "unbekannte Probe). Auch in Fleischgemischen lässt sich so die Frage beantworten, ob z.B. Rindfleisch enthalten ist. (Vgl. auch Text in der Einleitung zu diesem Versuch)

Lernvoraussetzungen:
Aufbau und Funktion von Proteinen, Proteinbiosynthese,

Sicherheit:
Unpolymerisiertes Acrylamid ist giftig! Schutzhandschuhe, Schutzbrille

Experiment:  SDS-PAGE

                                 Arbeitsschritt

Proteindenaturierung

 A1) - A2)

Pipettieren, Inkubieren

15'

A3) - A4)

Zentrifugieren, Pipettieren

5'

Gelelektrophorese

B1) - B2)

Herstellung des Polyacrylamid-Gels

45'

B3) 

Auftragen der Protein-Proben

15'

B4)

Elektrophorese

60'

Färben/Entfärben

C1) - C3)

Anfärben der Protein-Banden

20'

Herauswaschen der Hintergrundfärbung

30'

Archivierung

Auswertung

D)

5'

                                                                      Gesamtdauer:

ca. 3,5h