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Genetischer Fingerabdruck : Die DNA-Fingerprint - Technik 
(entwickelt 1985 von Alex Jeffreys, Universität Leicester)  

Molekularbiologische Informationen zu dieser Technik:
In kriminaltechnischen (= forensischen) Laboratorien werden genetische Fingerabdrücke untersucht, um die Überführung oder die Entlastung eines Verdächtigen an Hand von am Tatort gefundenen Spuren zu ermöglichen. Auch Verwandtschaftsverhältnisse (z.B. Vaterschaftsgutachten) lassen sich durch diese Methode klären (basierend auf der Tatsache, dass der genetische Fingerabdruck nach den Mendelschen Regeln je zur Hälfte von jedem Elter ererbt wird.)

Mit dem genetischen Fingerabdruck (auch "DNA-Profil" oder "DNA-Fingerprinting" genannt) haben die Strafverfolgungsbehörden seit Mitte der 80er Jahre ein ausgesprochen wirksames Mittel zur eindeutigen Identifizierung einer Person in der Hand. 

Wichtig: Der genetische Fingerabdruck erlaubt zwar eine Aussage über die Identität von Spurenverursacher und Tatverdächtigem. Nähere Aussagen zu Persönlichkeitsmerkmalen des Spurenverursachers (also z.B. Haar- oder Augenfarbe, Statur, Herkunft, Charakter etc.) erlaubt das Verfahren jedoch nicht, da die DNA aus Bereichen stammt, die keine Informationen codieren. 
Für den genetischen Fingerabdruck reichen Minispuren ( 5-10 µg DNA) aus, solange sie noch Erbmaterial enthalten beispielsweise die Blutspur an einem Glassplitter, die Wurzel eines ausgefallenen Haares oder Speichel- und Zellreste an einer Zigarettenkippe. 

Man vergleicht nicht das gesamte Erbgut, sondern nur charakteristische "Schnipsel", die sehr variabel sind, weil sie keine genetische Information tragen. (siehe unten)
In der Fachliteratur wird eine Wahrscheinlichkeit von 4x10-11 dafür genannt, dass zwei nicht verwandte Personen das gleiche Bandenmuster haben; bei Verwandten liegt sie immer noch unter 4x10-5. Nur bei eineiigen Zwillingen scheitert das Verfahren, denn die haben identische Erbanlagen. 

Seit 1998 wird beim BKA eine Gendatei aufgebaut. In ihr sollen die genetischen Fingerabdrücke bestimmter Tätergruppen auf Verdacht gespeichert werden. 
Im Fall Christina Nytsch (11) hatte man am Opfer Spermaspuren gefunden und suchte über einen Speicheltest nach dem passenden genetischen Muster des Täters. 1998 wurden ca. 12000 Männer zwischen 18 und 30 Jahren aus allen Nachbardörfern zum Speicheltest gebeten (-unter ihnen auch der dadurch überführte Mörder).
Das RFLP (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus)- Verfahren:
          (Benötigt werden 50.000 bis 500.000 Zellkerne)
In jeder Zelle tragen wir zwar unsere komplette Erbinformation (ca.3 Milliarden Basenpaare), doch in nur ca. 3 Prozent der DNA steckt der Bauplan unseres Körpers, 97 Prozent sind ohne bekannte Funktion (= nicht kodierende DNA). Auf verschiedene dieser "funktionslosen" Abschnitte (sog. Introns) haben es die Biologen abgesehen, denn ihre Längen sind von Mensch zu Mensch verschieden. 
Innerhalb dieser Abschnitte gibt es viele verschiedene sog.VNTR-Loci (Variable Number of Tandem Repeats), die aus Wiederholungen derselben kurzen Basensequenz (z.B. ACTG) bestehen. Diese Wiederholungssequenzen sind unterschiedlich lang, da sie bei verschiedenen Menschen in unterschiedlicher Anzahl vorliegen und von daher zur Identifizierung einer DNA-Probe herangezogen werden können. 
Man erwartet pro VNTR-Locus und untersuchter Person 2 Banden, die von den beiden homologen Chromosomen (eins vom Vater, eines von der Mutter) stammen.
Schema: Homologes Chromosomenpaar mit VNTR-Loci verschiedener Länge

Diese VNTR-Loci werden durch spezifische Schneide-Enzyme = Restriktionsenzyme als "Schnipsel" = DNA- Fragmente verschiedener Länge herausgeschnitten. Um sie der Länge nach zu sortieren und um sie sichtbar zu machen müssen noch eine Reihe weiterer Schritte folgen.
So läuft der Test im kriminaltechnischen Labor ab: (vereinfacht)
1) Gewinnung des DNA-haltigen Materials vom Tatort. (mindestens 50.000 Zellkerne)
2) Herstellung der Restriktionsfragmente.
Diese VNTR-Abschnitte sind von einer bestimmten Basenfolge eingerahmt, und können deshalb von spezifischen Schneideenzymen erkannt werden. Man spaltet also die DNA-Proben mit Restriktions- Enzymen, die ihre Erkennungssequenzen vor und hinter dem untersuchten VNTR-Locus, nicht aber innerhalb haben. 
3) Gelelektrophorese:
Nach der Spaltung werden die DNA- Fragmente auf einem Agarose-Gel im elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt. Die DNA-Stücke sind wegen der Phosphat- Gruppe negativ geladen und wandern zum Pluspol. Große Fragmente wandern langsamer als kleine.
5) Denaturierung und Blotting:
Aufspaltung der doppelsträngigen DNA- Bruchstücke in Einzelstränge (=Denaturierung) und Auftragung / Fixierung (=Blotting) auf einer speziellen Nylon- Membran.
6) Sichtbarmachung durch Gensonden:
Zugabe radioaktiv markierter Gensonden, das sind einsträngige DNA-Stücke, die eine komplementäre Basensequenz zu Nachbar-Bereichen des VNTR-Locus enthalten, und sich deshalb an die gesuchten DNA- Fragmente anlagern.
7) Autoradiographie:
Durch Auflegen eines Röntgenfilms ist es anschließend möglich, die Fragmente auf der Membran durch Schwärzung zu identifizieren. Es entstehen die charakteristischen Bandenmuster.

Führt man diesen Test bei hinreichend vielen verschiedenen VNTR-Loci durch, kann man eine Gewebeprobe mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit einer bestimmten Person zuordnen. Deshalb spricht man hier auch von einem genetischen Fingerabdruck.
Das PCR-Verfahren: DNA-Vervielfachung durch die Polymerase-Kettenreaktion
           
( Benötigt werden nur ca. 50-100 Zellkerne, das entspricht ca. 1milliardstel Gramm DNA )
Meist sind die Tatort-Spuren so winzig, dass für die RFLP-Methode zu wenig DNA vorliegt. Deshalb wird heute meist das PCR-Verfahren angewendet, für dessen Entwicklung Kary Mullis 1993 den Nobelpreis erhielt.. Hier werden ebenfalls die für jeden Menschen charakteristischen kurzen DNA-Loci mit Wiederholungssequenzen (s.o.) gesucht. Nur diese werden dann aber millionenfach im Reagenzglas vervielfacht (polymerase-chain-reaction). Dies ist möglich durch geeignete Startermoleküle. Als Ausgangsmaterial reichen wenige Zellkerne (max.500 Nukleotide). Anschließend werden die DNA-Fragmente -wie oben- der Länge nach durch Gelelektrophorese sortiert und nach Anfärbung ausgewertet.
2) Versuchsanleitung für die Simulation eines DNA-Fingerabdrucks:
    (c) Jan Brix, Chris Meisinger Inst. f. Biochemie und Mol.Genetik Univ. Freiburg
  • Der hier beschriebene Schulversuch simuliert die RFLP (Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus)- Methode. Es soll der genetische Fingerabdruck von fünf DNA-Proben (für einen VNTR-Locus) verglichen werden.
  • Eine dieser Proben soll direkt vom "Tatort" d.h. "Täter" stammen, vier weitere DNA-Proben sollen "Verdächtigen" entnommen worden sein. Diese Proben könnten aus Mundschleimhautzellen, Körperflüssigkeiten (Blut, Sperma), Haarwurzelzellen oder sogar aus mumifiziertem Gewebe von Fossilien gewonnen werden.
  • Statt menschlicher DNA nehmen wir (harmlose) Bakterien-DNA, und zwar vier verschiedene DNA-  Plasmide, die jeweils einen "Verdächtigen" repräsentieren sollen.

Jedes Plasmid wird mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen in charakteristische DNA-Fragmente zerlegt, durch Gelelektrophorese werden die DNA-Fragmente der Länge nach sortiert und mit einem Farbstoff sichtbar gemacht.
Durch Vergleich der vier erhaltenen Bandenmuster der "Verdächtigen"- Plasmide mit dem Bandenmuster des "Tatort"-Plasmids lässt sich dann einer der "Verdächtigen" als Spurenleger d.h. "Täter" überführen.

Arbeitsschritte:

Material:

Erläuterungen:

A)

Restriktions-

spaltung

der Plasmide

 

5 Eppendorf-Gefäße und Eppendorfständer Minireagenzgläser aus Plastik
2 Gilson-Pipetten(gelb) 2 Gilson-Pipetten(blau) gelb=20µl bzw.100µl blau =1000µl
Pipettenspitzen (gelb und blau) nicht an der Spitze anfassen!
Mini-Zentrifuge Zur Vermischung der Tropfen
Thermoblock Erhitzen der Eppendorf-Gefäße
Stoppuhr Dauer der DNA-Spaltung messen
5 Plasmid-DNA-Proben  (A,B,C,D und Tatort) Aufbewahrung: -20oC !
Pufferlösung B          (Aufbewahrung: -20oC) sorgt für zellähnliches Milieu
Restriktionsenzym BamH I  (Aufbewahrung:-20oC)

Erkennungssequenz:   

Restriktionsenzym Hind III  (Aufbewahrung:-20oC) Erkennungssequenz:     
Nucleic Acid Sample Loading Buffer (Aufbewahrung:-20oC) blauer Farbstoff für Elektrophorese 
Dest. steriles Wasser (autoklaviert) Lösungsmittel

B)

 Gel- 

elektrophorese

Elektrophoresekammer Siehe unten
Spannungsgerät    "          "
Mikrowellengerät Erhitzen:Agarose/Wassergemisch
Erlenmeyer 100ml, Messzylinder  Ansetzen des Gels
Agarose-Pulver Gel-Rohstoff (Agar)
elektron. Waage Abwiegen der Agarose
TAE-Puffer-Lösung Lösungsmittel, Leitfähigkeit
Marker-DNA Aufbewahrung: -20oC !
Schutzhandschuhe  

C) 
Färbung

Azur-B-Chloridlösung,  Färbeschale Färbung der DNA-Fragmente
dest. Wasser Entfärbung des Gels
Schutzhandschuhe  
 
Durchführung: 
A)  Restriktionsspaltung der DNA-Plasmide

     Thermoblock auf 37Grad vorheizen (s.A5)

          
A1) Stellen Sie die 5 Plasmid-DNA-Proben bereit.

Kühl halten bis zum Gebrauch!

A2) Stellen Sie ebenfalls 5 leere Eppendorf-Gefäße bereit und beschriften Sie diese wasserfest mit A, B, C, D, und Tatort.

A3) Pipettieren Sie nacheinander
     in jedes Eppendorf-Gefäß:
     (gelbe Pipette, gelbe P.Spitzen)
 10µl  DNA-Lösung (jeweils aus einer anderen Plasmidprobe)
  2µl Pufferlösung B
  2µl Schneide-Enzym BamH I
  2µl Schneide-Enzym Hind III
  4µl dest. Wasser (autoklaviert)

20µl Gesamtvolumen

Hinweise zum Pipettieren:
 - Pipetten nie an der Spitze anfassen.

 - Pipettenspitze bei Wechsel der Substanz immer wegwerfen.

 - Werden mehrere Substanzen in ein  Eppendorf-Gefäß pipettiert, nicht mit der Pipettenspitze in den vorigen Tropfen tauchen. Zur Sicherheit durch kurzes Zentrifugieren den Tropfen auf den Gefäß-Boden treiben.

 - Der letzte Tropfen Lösung in der Spitze der Mikropipette wird dadurch entfernt, dass die Innenwand des Gefäßes mit der Pipettenspitze berührt wird.

A4) Zentrifugieren (5Sek.) und vermischen der Substanzen durch vorsichtiges Antippen mit den Fingerspitzen.

A5) Anschließend werden die Eppendorf-Gefäße für 1 h bei 370C im Thermoblock inkubiert, bis der "Restriktionsverdau" abgeschlossen ist. Stoppuhr einstellen!   (Evtll. zwischendurch erneut mischen)
Während die Plasmide im Thermoblock gespalten werden, kann mit B1), der Herstellung des Agarose-Gels begonnen werden.
A6) Danach wird zu jeder Lösung 4µl  "Nucleic Acid Sample Loading Buffer" pipettiert und zentrifugiert/gemischt. Bei Bedarf könnte man jetzt die Proben einige Tage bei -20oC einfrieren.
B)  Gelelektrophorese:             Sortieren der DNA-Fragmente der Länge nach.

B1)

Herstellung 

des

Agarose-Gels

Zunächst wird die TAE-Pufferlösung angesetzt: 7ml TAE (kl.Messzylinder) werden mit dest. Wasser auf 350 ml Lösung aufgefüllt (gr.Messzylinder)
Gelherstellung: 0,3 g Agarose-Pulver wird mit 30 ml TAE in einem Erlenmeyerkolben in der Mikrowelle aufgekocht. (Einstellung: 400 Watt  1min)
Das Gel ist fertig, wenn die Lösung klar und ohne Schlieren und Klumpen ist! Kurz abkühlen lassen, bis ca. 55 Grad (Handrückentest!)
Gießen des Gels: Das flüssige Gel wird in den Gelschlitten eingefüllt.
Durch zwei schwarze Metallkeile wird verhindert, dass Gel in die benachbarten Elektrodenräume fließt. Der Schlitten muss so orientiert sein, dass die Bohrungen für den Kamm in Richtung des Minuspols (schwarz) liegen!
Nach Einstecken des Kamms mit 15 Zähnen härtet das Gel in ca. 15 min aus. Anschließend werden die Dichtungskeile gezogen und die restliche TAE-Puffer-Lösung (ca.300ml) wird in die Elektrodenkammern geschüttet, bis das Gel mit Pufferlösung bedeckt ist.

Achtung: A.6 nicht vergessen!

Kamm vorsichtig herausziehen. Zum Probenauftrag nimmt man die blaugefärbten Proben ggf. aus dem Gefrierschrank, lässt sie auftauen und zentrifugiert/ mischt sie kurz. Mit frischen Pipettenspitzen lässt man je 10µl DNA-Lösung in die Taschen des Gels hineinlaufen. Die Taschen dürfen nicht verletzt werden! Zum besseren Kontrast einen schwarzen Keil unter die Apparatur legen! 
Um die Größe der DNA-Fragmente abschätzen zu können, lässt man in der linken und rechten Rand-Tasche einen DNA-Marker mitlaufen.

B2)

Auftragen der

 Proben

 

B3)

 Elektrophorese

Der Deckel der Apparatur wird geschlossen und an das Spannungsgerät angeschlossen. Bei 100 Volt läuft die Elektrophorese ca.40-60min. Dann sollte die blaue Bande (Bromphenolblau) am unteren Ende (Pluspol) angekommen sein.
C)   Färbung der DNA - Banden
Nach Ausschalten der Spannung und Ziehen des Netzsteckers wird der Deckel der Apparatur wieder entfernt. Nun wird das Gel vorsichtig in eine kleine Färbeschale überführt. Vorsicht: Das Gel ist glitschig und brüchig!
Es wird ca. 100ml der Azur-B-Chlorid- Färbelösung zugegeben und für ca.10 min gefärbt. (Immer wieder schwenken!)
Die Färbelösung wird zurückgeschüttet. Anschließend werden zum Entfärben der Gelmatrix 100ml dest. Wasser zugegeben. Unter ständigem Schwenken und Erneuern des Wassers entfärbt sich die Gelmatrix. (Evtll. das Wasser in Mikrowelle erwärmen)
Das Gel kann jetzt zur Archivierung auf dem OH-Projektor fotografiert werden oder gescannt werden.

D)    Auswertung
Das Ergebnis des Versuchs "Genetischer Fingerabdruck durch RFLP (Simulation)" sollte sich in etwa so darstellen wie in der Abbildung. Die beiden Banden in jeder Bahn auf dem Gel (die dritte Bande bei Verdächtigem D mit ca. 12000 Basenpaaren (bp) wird vernachlässigt) mit unterschiedlichen Molekulargewichten (der Marker in der ganz rechten Bahn erlaubt ein Abschätzen der Fragmentgrößen) sollen die beiden VNTRs-Abschnitte der untersuchten Personen repräsentieren. Man erhält zwei Banden, da auf den zwei homologen Chromosomen in jedem menschlichen Genom das väterlich und mütterlich vererbte Erbgut enthalten ist. Ein gleiches Bandenmuster mit exakt gleichen Fragmentgrößen bedeutet mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit identische Personen.
Mit Hilfe des genetischen Fingerabdrucks lassen sich auch Verwandtschaftsverhältnisse nachweisen, z.B. in Vaterschaftstests. Hier muss beim Kind eine Bande mit der Mutter, die zweite mit dem Vater identisch sein. Man betrachte dazu die Abbildung. Wer ist der Vater?

In einem Mordfall in Arizona wurde zum ersten Mal in der Justizgeschichte der DNA-Fingerabdruck einer Pflanze benötigt.
Im Auto eines Verdächtigen fand man zwei Samen des Palo-Verde-Baumes, einer Baumart, die auch am Tatort gefunden wurde. Der Verdächtige bestritt, je am Tatort gewesen zu sein. Durch Vergleich der auch bei Pflanzen vorkommenden hochvariablen VNTRs konnte der Same einem bestimmten Baum in der Einfahrt zum Tatort zugeordnet werden.

 

Zeitplanung:

Experiment:  DNA-Fingerabdruck

Arbeitsschritt

Restriktionsspaltung
der Plasmide

A1)-A4)

Pipettieren

15'

 

A5) 

Schneiden der DNA

60'

B1) zeitgleich mit A5)

Gelelektrophorese

B1) 

Herstellung des Agarose-Gels

30' Pause/ Theorie

B2) 

Auftragen der DNA-Fragmente

15'

 

B3)

Elektrophorese

40'

Aufräumen

Färben/Entfärben


C)

Anfärben der DNA-Banden

15'

 

Herauswaschen der Hintergrundfärbung

20'

 

Auswertung

D)

 

10'

 

                                                                      Gesamtdauer:

ca. 3h

 

Zahl der Schüler :
Das NaT-Working -Set zur DNA-Untersuchung enthält 2 Elektrophoresekammern. Somit können zwei Schüler-Arbeitsgruppen zeitgleich die Arbeitsschritte zur DNA-Spaltung und Elektrophorese durchführen.

Lernvoraussetzungen:
  Bau der Bakterienzelle, Plasmide, Bau und Funktion der DNA

Restriktionsenzyme:

Funktion der Restriktionsenzyme: Ein Restriktionsenzym (genauer: Restriktionsendonucleasen) erkennt eine ganz bestimmte Nukleotidsequenz in der DNA und kann die DNA an dieser Stelle spalten (schneiden). Es gibt verschiedene Sorten von Restriktionsenzymen für unterschiedliche Schnitte. Sie werden aus Bakterien gewonnen. Ihre biologische Aufgabe ist es, die eingedrungene DNA von Phagen unschädlich zu machen.
Elektrophorese:
Trennprinzip der Gelelektrophorese: Unter Elektrophorese versteht man eine Trennmethode für biologische Moleküle (Proteine, DNA, RNA) mit Hilfe eines elektrischen Feldes. Die in der Pufferlösung negativ geladenen DNA-Fragrnente wandern im elektrischen Feld, wobei die kleineren DNA-Stücke schneller durch das Maschenwerk des Agarose-Gels gelangen als die größeren. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit einem speziellen Farbstoff angefärbt, um die einzelnen DNA-Banden sichtbar zu machen. Jede Bande enthält Millionen von DNA-Bruchstücken von einer ganz bestimmten Größe.

Sicherheit:
DNA und Enzyme: Die Plasmid-DNA sowie die Restriktionsenzyme, die in diesem Versuch verwendet werden, können gefahrlos gehandhabt werden. Es werden keine lebenden Organismen verwendet, so dass keine Maßnahmen zur Desinfektion getroffen werden müssen. Sauberkeit ist jedoch wichtig, um Kreuzkontaminationen innerhalb der Versuchsansätze (darunter fällt z.B. die unbeabsichtigte Übertragung von Enzymen zwischen verschiedenen Reaktionsröhrchen) zu vermeiden und gute Ergebnisse zu erzielen. Einwegspitzen und Mikroröhrchen können gefahrlos im Abfalleimer für Kunststoff-Recycling entsorgt werden.
Agarose-Gel: Wenn ein Mikrowellengerät zum Schmelzen des Agarose-Geles eingesetzt wird, ist es wichtig, das Gel in ein unverschlossenes Gefäß zu stellen. Um ein Anbrennen oder Verklumpen zu verhindern, muss das Gel gerührt werden.
VORSICHT! Heiße, geschmolzene Agarose kann plötzlich überkochen (Siedeverzug!). Sie muss daher vorsichtig gehandhabt werden.
DNA-Färbemittel: Es müssen Schutzhandschuhe getragen werden, um zu verhindern, dass die DNA-Färbelösung mit der Haut in Berührung kommt. Sie ist zwar nicht giftig-, die Haut nimmt aber vorübergehend den Farbstoff an.
VORSICHT! Die Gelelektrophorese-Apparatur arbeitet mit 100 Volt Gleichspannung. 
Literatur:
-Experimente zur molekularen Biologie: Jan Brix / Chris Meisinger  Inst. f. Biochemie Universität Freiburg 2001
-Dokumentation der Lehrerfortbildung "Gentechnik bei Pflanzen" Stuttgart März 2000
-Schlüter Biologie:Genetischer Fingerabdruck / -ChiuZ 1994 Nr.2 / -UB Nr.246/Juli1999 / -PdN-Bio Nr.7 1995 u.Nr.2 2000